動物細(xì)胞培養(yǎng)

一、試驗?zāi)康摹?/strong>
1、掌握無菌操作技術(shù)。
2、掌握原代和傳代細(xì)胞培養(yǎng)。
3、掌握細(xì)胞冷凍和復(fù)蘇技術(shù)。
4、了解培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的形態(tài)。
二、試驗原理。
將動物機(jī)體的組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。
細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
對具有移動特性的穩(wěn)定細(xì)胞系或細(xì)胞株進(jìn)行長期保存，一方面可以作為細(xì)胞研究的試驗材料，另一方面可以做細(xì)胞制品的生產(chǎn)材料。目前廣泛應(yīng)用的細(xì)胞保存方法是低溫冷凍保存法，。細(xì)胞的冷凍保存的原則是慢凍快融，這樣做是為了防止細(xì)胞由于冷凍過程中產(chǎn)生了冰晶而發(fā)生細(xì)胞破裂。
三、實驗器材及藥品。
器材：懷孕的小白鼠、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液器、眼科剪、鑷子、酒精燈、離心機(jī)、水浴鍋、倒置顯微鏡、CO₂培養(yǎng)箱、超凈工作臺、離心管、高壓滅菌鍋、試管架等。
藥品：小牛血清、DMEM合成培養(yǎng)基、抗生素、DMSO冷凍劑、胰酶、PBS緩沖液等。
四、實驗操作。
1、消毒滅菌。
將實驗所需用到的工具（如槍頭、培養(yǎng)皿、眼科剪、鑷子以及每個人的實驗服等）集中滅菌、烘干。配制75%的酒精以備實驗時所需。
2、培養(yǎng)基的配制。
分別取10ml的小牛血清、90ml的DMEM合成培養(yǎng)基，將兩種培養(yǎng)基混合在一起，再向其中加入1ml的抗生素，吹打混勻就得到了細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液。
3、原代培養(yǎng)。
（1）、準(zhǔn)備。將實驗過程中會用到的工具以及藥品全部放在超凈工作臺上進(jìn)行紫外消毒滅菌。實驗開始前帶好乳膠手套，用酒精對手進(jìn)行消毒。將懷孕的小白鼠放在酒精中殺死，取出子宮內(nèi)的胚胎組織。
（2）、剪切與消化。將胚胎組織放于平板中，用眼科剪將組織塊剪碎，剪得越碎越好。將剪碎的組織塊放于離心管中，加入大約200µl的胰酶進(jìn)行消化。也可將其置于37度恒溫箱中進(jìn)行消化。
（3）、分離細(xì)胞。消化到一定時間時，如果離心管中的溶液中出現(xiàn)了明顯的渾濁，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞，則應(yīng)該加入與胰酶等量的培養(yǎng)液終止消化。離心管于離心機(jī)中離心，棄上清液，得到分散的細(xì)胞。
（4）、轉(zhuǎn)移細(xì)胞并培養(yǎng)。向含有分散細(xì)胞的離心管中加入配制好的培養(yǎng)液，吹打混勻，將培養(yǎng)液用移液器移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。置于36.5℃恒溫CO₂箱培養(yǎng)，瓶口少少擰的松一點。
4、傳代培養(yǎng)。
（1）、倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的長勢及密度，根據(jù)細(xì)胞密度決定傳代的稀釋倍數(shù)。
（2）、收集原代培養(yǎng)的細(xì)胞。吸出培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，并用PBS沖洗兩遍。然后向培養(yǎng)瓶中加入200µl的胰酶進(jìn)行消化。消化一段時間后用配置好的培養(yǎng)液等比例終止消化。然后離心，收集到原代培養(yǎng)的細(xì)胞。
（3）、傳代細(xì)胞的培養(yǎng)。向離心管內(nèi)加入大約7—8ml的培養(yǎng)液，吹打混勻。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，置于37度恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)1—2天后于顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。
5、細(xì)胞冷凍保存。
（1）、收集細(xì)胞。吸出培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，并用PBS沖洗兩遍。然后向培養(yǎng)瓶中加入200µl的胰酶進(jìn)行消化。消化一段時間后用配置好的培養(yǎng)液等比例終止消化。然后離心，收集細(xì)胞。
（2）、冷凍。向離心管中加入一定量的培養(yǎng)液以及10%—20%的DMSO冷凍液，吹打混勻并轉(zhuǎn)移到冷凍管中。先將冷凍管在4度冰箱中放置10min，再放在—70度的冰箱中冷凍過夜。
（3）、復(fù)蘇。將冷凍的細(xì)胞取出來后，立刻放在40度水浴中，使其快速融化。并對融化的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的觀察。
五、實驗結(jié)果。

傳代細(xì)胞

傳代**次換液細(xì)胞

原代**次的細(xì)胞

原代第四天的細(xì)胞

冷凍復(fù)蘇的細(xì)胞
六、實驗分析與討論。
從本次實驗的圖片可以看出來，實驗做得還算成功，細(xì)胞基本上沒有被污染。在做的過程中一定要非常注意無菌操作，這是決定試驗成功的關(guān)鍵因素。在做原代培養(yǎng)的時候，一定要將小鼠胚胎的組織塊剪得夠碎，確保在用胰酶消化后可以得到分離的單個細(xì)胞。在做傳代培養(yǎng)時，要把握好胰酶的消化時間。冷凍復(fù)蘇時，一定要按照步驟進(jìn)行冷凍，遵循慢凍速溶的原則。#p#分頁標(biāo)題#e#

上一篇：細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分有哪些

下一篇：細(xì)胞培養(yǎng)升級篇

相關(guān)文章

漩渦混合器是一種高效能的流體混合設(shè)備，它通過高速旋轉(zhuǎn)的葉片將...

Vortex機(jī)器人VortexNode是一款非常出色的智能設(shè)...

漩渦混合器是一種用于攪拌液體的設(shè)備，通過旋轉(zhuǎn)的葉片將液體進(jìn)行...

旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器：現(xiàn)代生物科學(xué)的利器

撰寫一篇關(guān)于磁力攪拌器的文章，旨在詳細(xì)介紹此類設(shè)備的基本原理、應(yīng)用領(lǐng)域以及使用方法。

微型臺式真空泵：高效、小巧且實用

文章旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器：實驗室必備工具

撰寫一篇關(guān)于恒溫加熱平臺的文章，需要詳細(xì)說明其原理、應(yīng)用領(lǐng)域以及如何選擇合適的恒溫加熱平臺。為了確保質(zhì)量，我們將會采用一種安全和有效的技術(shù)，并將提供一些實用的建議。

成人av观看_日本五月婷婷_久草在线资源视频_天天干天天谢_jizz在线观看_精久久久

動物細(xì)胞培養(yǎng)

海門其林貝爾渦旋振蕩器旋渦混合器QL-861

海門其林貝爾旋渦混合器渦旋振蕩器XW-80A

海門其林貝爾旋渦混合器,渦旋振蕩器VORTEX-5

海門其林貝爾脫色搖床（數(shù)顯、定時）TS-1000（升級版）