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細菌內(nèi)毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1.0目標(biāo)

制定程序是為細菌內(nèi)毒素測試提供指導(dǎo)。

2.0范圍

此程序適用于細菌內(nèi)毒素測試。

3.0責(zé)任

微生物學(xué)家

4.0問責(zé)制

質(zhì)量檢查和質(zhì)量控制主管

5.0程序

5.1總則

5.1.1清潔所有必需的玻璃器皿,并按照SOP進行去熱原,以便對玻璃器皿進行去熱原。
5.1.2將所有無熱原玻璃器皿轉(zhuǎn)移到BET室。
5.1.3開關(guān)“ON”加熱塊按照操作用于指令的SOP 加熱塊,并在37設(shè)定的溫度°C
5.1.4 MVD計算為下述式樣品試樣-
MVD計算
5.1.5用LRW將待測樣品稀釋至四分之一MVD,并在渦旋振蕩器上振蕩3分鐘。
5.1.6注射用水的取樣和測試:按照取樣計劃,將注射用水樣品收集在去熱原的小瓶或試管中。注射用水應(yīng)  根據(jù)分析方法進行測試。

5.2制定控制標(biāo)準(zhǔn)(CSE)

5.2.1按照制造商提供的瓶子和制造商提供的說明中的說明重新配制LRW中的CSE,并間歇渦旋30分鐘。
5.2.2重構(gòu)后4周內(nèi)使用重構(gòu)后的CSE。
5.2.3用LRW制備CSE稀釋液以產(chǎn)生1EU / ml,并在渦旋中搖動稀釋液3分鐘。
5.2.4通過稀釋體積制備4λ,相當(dāng)于從1 EU / ml到LRW的4λ濃度。將稀釋液在漩渦中搖動3分鐘。(4λ由l濃度反算,即λ是裂解物的靈敏度)。

5.3裂解液的重建

5.3.1現(xiàn)在,在無菌刀片的幫助下,通過打開裂解液的鋁質(zhì)封口來重新配制裂解液。
5.3.2通過在堅硬的表面上敲擊,將裂解物粉末收集到樣品瓶的底部。然后慢慢打開軟木塞。
5.3.3按照制造商的說明,在使用前添加LRW或緩沖溶液,并立即更換軟木塞。

5.4標(biāo)記的裂解液敏感性的確認

5.4.1重復(fù)四次確認,然后在測試中使用裂解物溶液的標(biāo)記靈敏度λ,以EU / ml或IU / ml表示。當(dāng)使用新一批的裂解物或?qū)嶒灄l件發(fā)生任何變化而可能影響測試結(jié)果時,必須進行裂解物敏感性的確認。
5.4.2通過將一系列CSE溶液用水稀釋成BET(LRW),用至少四種等于2λ,λ0.5λ和0.25λ的濃度的4λ溶液制備CSE稀釋液。
5.4.3取10個去熱原化驗管,并通過編號對管進行標(biāo)記并將其一式四份排列在架子上,然后按照下表進行操作-?
稀釋
5.4.4分別將100 ml稀釋的CSE(即分別為2λ,λ,0.5λ和0.25λ)移入去熱原的試管(10 mm x 75 mm)中,并進行相應(yīng)標(biāo)記。對于NWC(負水控制),請分別使用100 ml LRW,并一式四份進行測試。
5.4.5在每個試管中加入100毫升重構(gòu)的裂解液,并輕輕混合。
5.4.6將反應(yīng)混合物在37°±1°下恒溫孵育60±2分鐘,避免振動。
5.4.7孵育后,取每個試管,直接從培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)過來,以一個平穩(wěn)的動作將其翻轉(zhuǎn)大約180°。如果形成了牢固的凝膠,該凝膠在反演后仍保留在原位,則記錄結(jié)果為陽性。如果未形成完整的凝膠,則結(jié)果為陰性。
5.4.8除非zui低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在所有重復(fù)測試中均顯示陰性結(jié)果,否則該測試無效。
5.4.9終點是內(nèi)毒素濃度下降系列中的zui后一個陽性結(jié)果。使用以下表達式計算終點濃度的對數(shù)平均值,然后計算平均值的對數(shù):
幾何平均數(shù)
5.4.10幾何平均終點濃度是裂解物溶液的測量靈敏度(EU / ml或IU / ml)。如果其不小于0.5λ且不大于2λ,則確認標(biāo)記的靈敏度并將其用于用該裂解物進行的測試中。

5.5測試程序

5.5.1如表1,
表– 1 所示制備溶液A,B,C和D
5.5.2取8根去熱原的化驗管并編號,并在對置的架子上進行標(biāo)記。例如,NPC為1&2,PPC為3&4,PWC為5&6,負水控制為7&8。
5.5.3在NPC和PWC中加入50毫升LRW,在NWC中加入100毫升。立即添加50 ml產(chǎn)品樣品,將其在NPC和PPC中以MVD / 4稀釋,然后添加50ml CSE,將其在PPC和PWC中稀釋至4λ。
5.5.4zui后在所有試管中加入100 ml裂解液,然后用手混合測定管并在加熱塊中孵育,在加熱塊中將溫度保持在37±1°C保持60±2分鐘。

5.6結(jié)果解釋

5.6.1凝膠凝塊法中的每個試管均被解釋為陽性或陰性,陽性試驗表明形成牢固的凝膠,當(dāng)試管倒置180°時能夠保持其完整性。
5.6.2陰性測試的特征是不存在凝膠或形成粘性物質(zhì),當(dāng)試管在180°倒置時粘性物質(zhì)不起作用。
5.6.3除非兩個陽性對照溶液B和C的兩個重復(fù)均為陽性,而陰性對照溶液D的兩個重復(fù)均為陰性,否則該測試無效。
5.6.4當(dāng)溶液A的兩個重復(fù)均發(fā)現(xiàn)陰性結(jié)果時,所檢查的制劑符合測試要求
。5.6.5溶液A的兩個重復(fù)均發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果時,則不符合測試要求。
5.6.6如果溶液A的一個重復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果,而另一溶液的陰性結(jié)果重復(fù)試驗。如果在重復(fù)測試中溶液A的兩次重復(fù)均發(fā)現(xiàn)陰性結(jié)果,則所檢查的制劑符合測試要求。

5.7故障調(diào)查

5.7.1當(dāng)在兩個測試準(zhǔn)備試管上都觀察到陽性結(jié)果時,通過檢查以下參數(shù)來調(diào)查其失敗的原因。
5.7.2檢查產(chǎn)品稀釋度,CSE稀釋度和裂解物稀釋度。
5.7.3是否按照SOP對玻璃器皿進行了清潔和去熱原處理。
5.7.4檢查裂解液批次和匹配的CSE的敏感性報告。
5.7.5檢查加熱塊溫度和校準(zhǔn)。
5.7.6檢查微量移液器校準(zhǔn)。
5.7.7檢查是否有微生物學(xué)家污染。

5.8注意事項

5.8.1復(fù)水的CSE可以在2至8°C下保存28天。
5.8.2提供的COA專門用于裂解液批次和CSE批次。因此,使用相同的批次進行測試
5.8.3請勿渦旋裂解液。

5.9頻率

5.9.1裂解物敏感性的確認–每批貨物。
5.9.2按照注射用水抽樣計劃。
5.9.3成品和原材料按批次進行。

6.0縮寫

SOP:標(biāo)準(zhǔn)操作程序
QA:質(zhì)量保證
QC:質(zhì)量控制
NA:不適用
BET:細菌內(nèi)毒素測試
CSE:對照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素
MVD:zui大有效稀釋液
LRW:Lal試劑水
PPC:陽性產(chǎn)品對照
NPC:陰性產(chǎn)品對照
PWC:陽性水控制
NWC:負水控制

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